基因突變的演化樹不僅能揭示不同組織中致癌細(xì)胞的相互關(guān)聯(lián)性，還能揭示癌癥的演化歷史。在癌癥早期，某些致癌基因發(fā)生突變，似乎是導(dǎo)致原發(fā)性腫瘤以及轉(zhuǎn)移性腫瘤的罪魁禍?zhǔn)住ａ槍υ缙诎l(fā)生突變的致癌基因研發(fā)的藥物，有可能成為癌癥治療(原發(fā)性腫瘤形成早期和癌癥末期)的關(guān)鍵。

未來，通過構(gòu)建患者個人的基因突變演化樹，我們很可能會找到治療耐藥性癌癥的策略。

1.生命之樹

長久以來，生物學(xué)家通過研究基因來了解“生命樹”的生長史。生命樹將地球上的所有生物聯(lián)系起來——無論它們是狨(一種世界上體型最小的猴)還是微生物。我們所屬的“智人”就是這棵枝葉繁茂的演化樹上的一張葉片，在它旁邊的那些葉片則是各種類人猿。而人類的每一個個體又是由各種人體細(xì)胞構(gòu)成的一個集合。

創(chuàng)意圖片《癌癥演化樹》

一般來說，這些細(xì)胞都共同遵守一個契約。在大約6億年前出現(xiàn)的第一批多細(xì)胞生物中，這一契約就已在反復(fù)試錯的基礎(chǔ)上建立起來了。按照這個契約，如果多個細(xì)胞要在一起共生，就必須遵守以下基本準(zhǔn)則：當(dāng)細(xì)胞中的DNA受損時須及時進(jìn)行修復(fù);細(xì)胞是否繼續(xù)進(jìn)行分裂繁殖須顧及相鄰細(xì)胞的意愿;細(xì)胞須待在相應(yīng)組織的特定位置。

通常情況下，那些導(dǎo)致細(xì)胞違反這些限制，開始不斷生長、擴(kuò)散(惡性腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志)的基因突變，可以通過細(xì)胞凋亡來消除。發(fā)生突變的細(xì)胞在發(fā)現(xiàn)自身問題后，會啟動自毀機(jī)制或在對身體造成危害前被免疫系統(tǒng)消滅。

然而在少數(shù)情況下，監(jiān)測系統(tǒng)失靈，細(xì)胞中的基因突變不斷累積，腫瘤就會生長擴(kuò)散。一棵惡性演化樹就此生根發(fā)芽。

研究人員已經(jīng)知道，一些基因突變對腫瘤的發(fā)生(即原始腫瘤的形成)起著推動作用。然而，真正致命的卻是癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性(即癌變細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤中逸出，侵入健康組織，并在那里產(chǎn)生新的腫瘤)。由于腫瘤學(xué)家認(rèn)為，只有在細(xì)胞發(fā)生了進(jìn)一步基因突變后，才會產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性腫瘤，而且這些突變發(fā)生在原發(fā)性腫瘤發(fā)展階段的晚期，所以他們通常致力于尋找這些基因突變，將其作為抗癌藥物的作用對象。

2010年左右，由于技術(shù)的進(jìn)步，科學(xué)家能夠以低廉的價格對人類基因組進(jìn)行測序——即推斷基因組的堿基(DNA的基本組成單位)序列。于是，多個研究機(jī)構(gòu)的研究小組開始對腫瘤的基因序列進(jìn)行全面研究。令人沮喪的是，研究人員發(fā)現(xiàn)，即使在同一個病人體內(nèi)，腫瘤所包含的基因變異也多得讓人眼花繚亂。

然而，像我這樣的演化生物學(xué)家卻將多樣性視為寶貴的信息來源。我決定與耶魯大學(xué)及其他研究機(jī)構(gòu)的同事一起，對這些基因突變之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究。我們對癌癥病人基因組中表達(dá)的那部分(已知的、控制蛋白質(zhì)表達(dá)并由此決定細(xì)胞特性的那部分DNA片段)進(jìn)行了測序。我們還進(jìn)一步利用這些信息，建立了與疾病相關(guān)的基因突變演化樹。該演化樹的分支向我們展示了，隨著癌癥從初始的幾個腫瘤細(xì)胞發(fā)展成具有轉(zhuǎn)移性的怪物，腫瘤內(nèi)部的基因在這一過程中是如何發(fā)生變化的。

2.神秘毒樹

我們的研究顯示，那些將原發(fā)性腫瘤與轉(zhuǎn)移性腫瘤聯(lián)系在一起的枝干，在病人的癌癥樹中似乎大量地隨機(jī)出現(xiàn)，就像一棵神秘的毒樹的樹枝。更令人驚訝的是，演化樹的第一批分支可以出現(xiàn)在原始腫瘤內(nèi)部。原發(fā)性腫瘤內(nèi)的不同細(xì)胞，可能在初始腫瘤得到確診的多年前，就演化成更具侵略性的形式，而且發(fā)生擴(kuò)散的遺傳機(jī)制也各不相同。

雖然這些發(fā)現(xiàn)很是駭人，但也給我們帶來了希望。這提醒癌癥研究人員，與其專注于晚期突變，不如更關(guān)注原發(fā)性腫瘤(癌癥樹的起源)中的早期基因突變。針對后者研發(fā)藥物，或許將增加癌癥病人康復(fù)的概率。

偏光顯微鏡下的轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞

數(shù)十年來，科學(xué)家一直使用一個線性模型來指導(dǎo)癌癥研究。根據(jù)該模型，腫瘤的產(chǎn)生是由一系列特定基因的突變導(dǎo)致的。只有這些基因突變發(fā)生后，原發(fā)性腫瘤內(nèi)部的一些細(xì)胞才會進(jìn)一步發(fā)生一個或多個突變，獲得轉(zhuǎn)移的能力。如果我們能針對這些基因突變構(gòu)建一棵演化樹，那么這棵樹的形狀將有點(diǎn)像草：又高又直，只有一根主干，葉片和種子生長在主干上接近頂部的位置。

該理論與演化生物學(xué)家深諳的生物演化史并不相同。不間斷的基因突變與選擇，促使生物物種出現(xiàn)分化，產(chǎn)生盡可能多樣的遺傳品系，而非單一的均質(zhì)種群。實際上，英國倫敦癌癥研究所的馬可·格爾林根及其他研究者的早期研究顯示，即使在原發(fā)性腫瘤中，不同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞都具有不同的基因序列。

2010年，我與我的實驗室成員(作者在美國耶魯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)，及耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的病理學(xué)家戴維·里姆、遺傳學(xué)家理查德·利夫頓和藥物學(xué)家約瑟夫·施勒辛格一起，致力于回答在研究過程中發(fā)現(xiàn)的3個問題。第一，癌癥的轉(zhuǎn)移是否需要一個或多個特定的基因突變，這些突變是否出現(xiàn)在所有病人中?第二，能否在多數(shù)基因突變累積起來之前，在原發(fā)性腫瘤發(fā)生的相對早期階段，就將轉(zhuǎn)移性品系從中分離出來?第三，如果在原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤中發(fā)現(xiàn)多種突變，我們能否利用演化樹來估計突變發(fā)生的時間?回答出這些問題，我們就可以描繪出導(dǎo)致原發(fā)性腫瘤產(chǎn)生以及引起腫瘤轉(zhuǎn)移的遺傳軌跡。

3.毒樹之果

當(dāng)時，我們并不知道，我們的演化學(xué)工具將會發(fā)揮多大的作用。里姆從40位死于13種癌癥的患者的原發(fā)性腫瘤、繼發(fā)性腫瘤及相鄰健康組織中提取了樣本。對于每一份樣本的基因組，只要是我們知道的在任何組織、任何時間表達(dá)過的基因片段，我們都會測定它的序列。我們在一個或多個癌變組織中，發(fā)現(xiàn)了數(shù)十至數(shù)千種異于病人體內(nèi)正常基因序列(即生殖細(xì)胞系的序列，來自于最初的受精卵)的基因突變。

為了了解這些樣本之間的關(guān)聯(lián)性，我們實驗室的博士后研究員趙子銘(音譯，Zi-MingZhao)為它們構(gòu)建了分子演化樹。這種樹狀圖原本是用來厘清人類與黑猩猩、大猩猩及紅毛猩猩之間的親緣關(guān)系，以及猿與其他哺乳動物、哺乳動物與鳥類及其他動物、動物與真菌、植物和細(xì)菌之間的關(guān)系?？茖W(xué)家通過比較這些物種在生物性狀(或其DNA序列)上的差異，將它們放置在演化樹上的不同位置。

然而，將這些技術(shù)應(yīng)用于癌癥并不簡單。通常，我們僅使用現(xiàn)有物種的基因序列來推測其祖先的相關(guān)信息。而在癌癥演化樹中，我們知道癌細(xì)胞祖先的基因序列：它是從健康組織中獲得的生殖細(xì)胞系序列。如果不做任何改變，按照傳統(tǒng)的做法，應(yīng)該把正常序列看作是一個“后代”種系，那么由此構(gòu)建的演化樹將不會反映我們所感興趣的歷史。于是，我們對這一經(jīng)典方法做了一些改變，將健康組織的基因序列作為原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞系的祖先，并據(jù)此構(gòu)建出最可能解釋這一系列變化的演化樹。

重新調(diào)整過的演化樹給我們帶來了一些驚人發(fā)現(xiàn)。根據(jù)存在已久的線性模型，所有的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞都源自一個從原發(fā)性腫瘤中逸出，并擴(kuò)散到其他部位的細(xì)胞系。如果轉(zhuǎn)移性腫瘤確實是這樣形成(即源自一系列DNA突變的最后一個突變)的，那么，與原發(fā)性腫瘤的基因序列相比，繼發(fā)性腫瘤的基因序列應(yīng)該與其他繼發(fā)性腫瘤更接近。

但我們觀察到的事實卻并非如此。當(dāng)我們開始研究癌癥演化樹時，我們發(fā)現(xiàn)，有些病人的原發(fā)性腫瘤與一些轉(zhuǎn)移性腫瘤的親緣關(guān)系較近，而與另一些轉(zhuǎn)移性腫瘤的親緣關(guān)系卻較遠(yuǎn)。這一發(fā)現(xiàn)表明，在某一時間，原發(fā)性腫瘤內(nèi)部變成轉(zhuǎn)移性腫瘤的細(xì)胞系有多個而非一個。實際上，在我們構(gòu)建的高分辨率的演化樹中，這種模式出現(xiàn)的概率超過了1/3。

4.演化樹與時間樹

經(jīng)典的線性模型與實際數(shù)據(jù)不符，這讓我們感到很驚訝。我們的證據(jù)顯示，誘發(fā)癌癥轉(zhuǎn)移的并非單一的罕發(fā)事件，早期發(fā)生的、導(dǎo)致腫瘤增殖的基因突變，也會提升腫瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移能力。

而且，對那些變成轉(zhuǎn)移性腫瘤的細(xì)胞系，我們無法將其轉(zhuǎn)移性歸因于任何單一的基因突變。除了那些已知的驅(qū)動腫瘤產(chǎn)生的主要基因(例如，幾乎在所有胰腺癌病人的原發(fā)性腫瘤中，KRAS基因都發(fā)生了突變)，多名病人的轉(zhuǎn)移性腫瘤中并沒有發(fā)生特定的基因突變。實際上，在那些指向繼發(fā)性腫瘤的分支中發(fā)現(xiàn)的基因變異，與那些從未離開過原發(fā)性腫瘤的細(xì)胞系中的基因變異，并沒有顯著不同。在原發(fā)性腫瘤細(xì)胞中，基因突變之外的其他因素(如表觀遺傳變化，即DNA序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變)，或細(xì)胞的微環(huán)境發(fā)生了變化，更有可能導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)移。

原發(fā)性腫瘤細(xì)胞中發(fā)生的表觀遺傳修飾(例如偶然接觸致癌物質(zhì)導(dǎo)致的變化)，可能增加細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率。細(xì)胞所處的位置也會影響它們的轉(zhuǎn)移性。例如，一些腫瘤細(xì)胞可能因為正好接近血管或淋巴管，就更容易擴(kuò)散到全身，而其他具有相同基因突變的腫瘤細(xì)胞，則可能由于所處位置離血管或淋巴管較遠(yuǎn)，而不容易發(fā)生擴(kuò)散。這些可能影響腫瘤轉(zhuǎn)移的因素，或許與后期出現(xiàn)在我們的癌癥演化樹上的基因突變關(guān)系不大。

搞清楚原發(fā)性腫瘤有時會產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)移性腫瘤后，接下來我們想知道，到底早在什么時候，這些轉(zhuǎn)移性的腫瘤細(xì)胞系就開始出現(xiàn)差異了。我們的分子演化樹無法回答這個問題：這些分支的長短對應(yīng)的并非實際時間，而是用以區(qū)分癌癥各部分(如原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤)的基因突變的數(shù)量。所以，演化樹不會告訴我們，一個腫瘤產(chǎn)生新的腫瘤所需的時間長短。

于是我們就想，是否可以使用演化生物學(xué)的另一項技術(shù)——時間樹，來了解人體內(nèi)癌癥的發(fā)展過程。不同于分子演化樹，時間樹中的分支長度對應(yīng)著一個生物物種演化形成另一物種所耗費(fèi)的時間。構(gòu)建時間樹的原理是，先對比相關(guān)特性(如基因序列)，然后將這些特征與時間信息(如突變率)聯(lián)系起來，進(jìn)而讓科學(xué)家可以推測重要突變發(fā)生的時間。這種技術(shù)已用于化石數(shù)據(jù)的分析，比如，確定“寒武紀(jì)生命大爆發(fā)”(Cambrianexplosion，指5.5億年前各種多細(xì)胞生物突然大量出現(xiàn))的發(fā)生時間。

雖然我們沒有化石來校正個體一生中癌癥的演化過程，但我們卻擁有更好的研究材料。在很多情況下，我們擁有尸檢之前的各種原始組織。我們還有每個病例的醫(yī)療記錄，能提供病人出生、診斷、活檢、腫瘤取出以及尸檢的日期，而這些日期則可以作為時間校正點(diǎn)。例如，癌癥不可能發(fā)生在個體出生之前，而原發(fā)性腫瘤在確診之前就已存在于身體中?；顧z及腫瘤取出時所采集的組織樣本，則給我們提供了癌癥演化過程中各時期的快照。這些日期能讓我們推算出發(fā)生突變的速率。此外，我們還能找到放射科醫(yī)生發(fā)表的關(guān)于原發(fā)性腫瘤細(xì)胞分裂速度的數(shù)據(jù)(放射科醫(yī)生收集這些信息是為了估計放射療法中殺死腫瘤細(xì)胞所需使用的輻射強(qiáng)度)。

我們實驗室的另一位博士后研究員阿蒂拉·伊阿瑪里諾利用所有這些信息，將分子演化樹變成了時間樹。我們第一次看到了，癌癥是如何循著病人的生命軌跡演化的，還看到病人接受治療的時間長短是如何影響癌癥演化的。據(jù)此，我們可以估算致癌基因突變發(fā)生的時間。對年輕病人來說，細(xì)胞癌變通常發(fā)生在確診之前的幾年內(nèi);而對年紀(jì)較大的病人來說中，這種突變則可能發(fā)生在幾十年前。

5.尋找突破口

通常，在癌癥確診的多年前(有時甚至是數(shù)十年前)，讓腫瘤組織有別于正常組織的第一個基因突變就已經(jīng)發(fā)生了。同樣令人不安的是，我們在研究中發(fā)現(xiàn)，90%的病人在確診時體內(nèi)就已存在至少一個轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞系。在70%的病例中，這種惡性腫瘤的分支從主干中分出來的時間，離原發(fā)性腫瘤產(chǎn)生的時間更近，而距離病人死亡的時間還有很遠(yuǎn)。

得到這樣的結(jié)果，我們非常吃驚，因為這實在太重要了。那些后來變成轉(zhuǎn)移性腫瘤的細(xì)胞，與原發(fā)性腫瘤中其他細(xì)胞的基因差異，在癌癥早期(無論是就演化階段還是時間而言)就已顯現(xiàn)出來了。實際上，這些基因差異往往早在原發(fā)性腫瘤得以確診前，就已經(jīng)出現(xiàn)了。

我們本來希望找出誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移性的關(guān)鍵基因突變，作為藥物干預(yù)的作用目標(biāo)，但是，因為轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞系的基因突變并無特異性，我們便把注意力從轉(zhuǎn)移性腫瘤轉(zhuǎn)向原始腫瘤的演化史。我們想知道，演化樹的主干，也就是原發(fā)性腫瘤細(xì)胞的基因序列，是否在癌癥的形成中起著特殊的作用。為了回答這一問題，我們決定弄清楚，發(fā)生在病人原發(fā)性腫瘤細(xì)胞中的基因突變，是否改變了某些與癌癥相關(guān)的基因的功能。

結(jié)果確如所料。例如，著名的腫瘤抑制基因p53(抑制細(xì)胞增殖)，就在很多病人的腫瘤演化早期發(fā)生了突變。原癌基因(proto-oncogene)KRAS也是這樣[原癌基因一旦發(fā)生突變就會變成促使細(xì)胞不斷分裂的致癌基因(oncogene)]。幾乎所有的胰腺癌患者都在KRAS基因的第12位點(diǎn)上發(fā)生了早期突變。

這類關(guān)鍵基因在癌癥演化樹的根部頻繁出現(xiàn)，暗示著它們在腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。我們推測，隨著與腫瘤發(fā)生相關(guān)的突變越來越多，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性就成了一個數(shù)字游戲：癌細(xì)胞數(shù)量越多，它們就有更大的概率找到便于擴(kuò)散的位點(diǎn)，或者發(fā)生表觀遺傳改變，從而獲得轉(zhuǎn)移性。

要弄清楚這些關(guān)鍵基因是如何影響腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移概率，還需要進(jìn)一步研究。即便如此，早期的誘發(fā)因素還是值得我們投入更多關(guān)注，因為針對它們研發(fā)的藥物，可能成為癌癥治療的關(guān)鍵——不管是對于早期的原發(fā)性腫瘤，還是晚期癌癥，都是如此。

6.清除癌癥樹

最新臨床試驗已經(jīng)證實，人類有可能利用自身免疫系統(tǒng)來殺死癌細(xì)胞。然而，腫瘤似乎針對藥物療法和免疫療法演化出了相應(yīng)的耐受機(jī)制。癌細(xì)胞的耐受性是否像原發(fā)性腫瘤一樣，源于特定的基因突變?或者像轉(zhuǎn)移性腫瘤一樣，受微環(huán)境和其他因素的影響?目前，我們尚不知曉答案，但是癌細(xì)胞的演化樹將有助于我們弄清這一問題。

通過對時間樹進(jìn)行研究，我們的發(fā)現(xiàn)，一些不那么有名的、可能引發(fā)癌癥的基因也發(fā)生了突變，但這些基因突變往往是在癌癥后期發(fā)生的。也就是說，這些基因突變并不處于癌癥樹的主干，而處于分支位置，因此這些突變通常只出現(xiàn)在某些病人的腫瘤中，而在另一些病人的腫瘤中則不存在。所以，針對這類突變的療法雖然能消滅這些分支突變，但癌癥樹的其他部分卻會繼續(xù)繁殖，危及病人的生命。我們相信，如果醫(yī)生能在使用這類藥物的同時，輔以殺死其他種類的癌細(xì)胞的療法，就能事半功倍。

創(chuàng)意圖片《呵護(hù)生命》光明圖片/視覺中國

從另一方面來講，如果一種藥物針對的是一個存在于所有腫瘤的早期突變，隨著含有特定新突變的癌細(xì)胞增殖，癌癥可能會對該藥物產(chǎn)生耐受性。美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的病理學(xué)家凱特琳娜·波利蒂及同事發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在EGFR基因[另一主要的致癌(特別是肺癌)基因]上的突變，對癌癥耐藥性的產(chǎn)生起著重要作用。為了搞清楚癌癥病人在接受治療時，癌細(xì)胞為什么以及如何產(chǎn)生耐受性，我們的研究小組再次使用了演化生物學(xué)技術(shù)。我們構(gòu)建了病人的癌癥樹，尋找導(dǎo)致耐藥性腫瘤(復(fù)發(fā)性腫瘤)的基因突變。令人鼓舞的是，我們的初步研究顯示，耐藥性的產(chǎn)生似乎的確是由病人接受治療導(dǎo)致的基因突變引起的。

現(xiàn)在，每年都會有許多新的針對特定基因突變的抗癌藥物上市，傳統(tǒng)化療、放療和免疫療法相結(jié)合的復(fù)合療法也表現(xiàn)出了越來越大的潛力。腫瘤學(xué)家不再將一種癌癥看作是可以一概而論的疾病。而是認(rèn)為，每一個病例都有其自身的特點(diǎn)。研究病人個體的基因組，將會對未來的癌癥治療產(chǎn)生巨大影響。為了更好地利用這些新工具，腫瘤學(xué)家必須成為真正的演化生物學(xué)家，只有這樣，才能通過檢測每位病人癌組織中的基因突變，制定有效策略，摧毀癌癥樹的根源和分支。