在人類基因組中95%的基因并不編碼蛋白質(zhì)，其他物種也有大量的非編碼基因。這些DNA不會(huì)被編碼成蛋白質(zhì)，卻又會(huì)轉(zhuǎn)錄出非編碼RNA，它們對(duì)生命活動(dòng)起什么作用?是進(jìn)化的冗余還是神秘的緩存?

《細(xì)胞》雜志近日刊登中國(guó)工程院院士曹雪濤團(tuán)隊(duì)的研究論文，他們發(fā)現(xiàn)一種全新非編碼RNA分子。該分子能夠調(diào)控免疫系統(tǒng)的“進(jìn)”與“退”，這是此前學(xué)術(shù)界從未認(rèn)識(shí)和證明的。

“由于長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)豐度低，業(yè)界對(duì)其功能爭(zhēng)議很大。”浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院教授徐平龍?jiān)诖饲敖邮懿稍L時(shí)評(píng)價(jià)道，但此次發(fā)表的研究嚴(yán)謹(jǐn)?shù)罔b定了所發(fā)現(xiàn)的一種全新lncRNA是有功能的，即能夠進(jìn)行免疫調(diào)控，而曹雪濤院士正是這一機(jī)制的主要開拓者之一。

大海撈針 從浩淼細(xì)胞中層層篩選而出

細(xì)胞雖小，卻瀚如乾坤。尋找一個(gè)不知道存不存在的RNA分子，如大海撈針。

到哪里找線索?病毒感染給了曹雪濤啟示。談到為什么會(huì)從病毒這個(gè)“敵人”的角度考慮。曹雪濤講道：“我們中國(guó)文化講，陰中有陽(yáng)、陽(yáng)中有陰，這是外國(guó)人很難理解的。這一哲理指導(dǎo)我們對(duì)免疫系統(tǒng)的理解就是，激活和抑制很可能會(huì)交融在一處，那么我們就從這個(gè)‘交融點(diǎn)’突破解題。”

既然體內(nèi)蛋白能夠識(shí)別外來(lái)的病毒RNA，能不能識(shí)別體內(nèi)自身RNA呢?

科學(xué)界大部分認(rèn)為不能。“免疫系統(tǒng)擁有識(shí)別‘自我’‘非我’的能力，就好像邊境衛(wèi)士，對(duì)外來(lái)的侵害反應(yīng)敏感，對(duì)轄內(nèi)‘居民’熟視無(wú)睹。”曹雪濤院士團(tuán)隊(duì)成員之一、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所教授姜明紅說(shuō)，“但是曹老師并不這么看，他說(shuō)，究竟是不是熟視無(wú)睹，你要證明才行。”

在中國(guó)傳統(tǒng)哲理思想的指引下，曹雪濤鎖定了一個(gè)已知的關(guān)鍵蛋白——“RIG-I”，求證這個(gè)能與病毒RNA結(jié)合的蛋白，會(huì)不會(huì)和體內(nèi)自身的RNA分子結(jié)合。

RIG-I很像一個(gè)分子水平的“老鼠夾子”，2011年有科學(xué)家解析了這個(gè)蛋白的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)“老鼠(病毒RNA)”沒(méi)來(lái)的時(shí)候，夾子合著，兩頭的結(jié)構(gòu)域相互作用，蛋白處于“閉合”狀態(tài);一旦“老鼠”來(lái)了，與夾子的一頭結(jié)合，另一頭就會(huì)“彈開”，蛋白遂處于激活狀態(tài)。而這樣的構(gòu)象變化，會(huì)引發(fā)細(xì)胞合成出關(guān)鍵的抗病毒分子——干擾素，干擾素分泌后被周圍細(xì)胞接受，引發(fā)抗病毒的“連鎖反應(yīng)”。

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)紫外加強(qiáng)RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(UV-RIP)的方法，將“老鼠夾子”和它獵捕的“老鼠”同時(shí)從細(xì)胞中分離出來(lái)。隨后通過(guò)蛋白質(zhì)變性等方法，把“老鼠夾子”過(guò)濾掉，就獲得與RIG-I結(jié)合的所有RNA。

夾子“釣”上來(lái)的所有RNA中，有沒(méi)有未被發(fā)現(xiàn)的有功能的lncRNA呢?

將“撈針”的范圍鎖定夾子“釣”上來(lái)的RNA后，團(tuán)隊(duì)又通過(guò)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的干擾實(shí)驗(yàn)繼續(xù)縮小范圍，即看究竟哪個(gè)RNA被封殺之后，免疫活動(dòng)不再被抑制。功能篩選幫助團(tuán)隊(duì)鎖定了一批備選者并列出“排名”。排名靠前的RNA分子，且與特定信號(hào)通路相關(guān)的lnc-Lsm3b被鎖定，一個(gè)新的RNA分子從浩淼的小鼠巨噬細(xì)胞中經(jīng)過(guò)層層篩選被“打撈”上來(lái)，并獲得了確切的序列。

團(tuán)隊(duì)后續(xù)開展了多角度的證明工作，如通過(guò)干擾、敲除、過(guò)度表達(dá)等技術(shù)，反復(fù)證明lnc-Lsm3b能夠在病毒感染的細(xì)胞中，通過(guò)“分子誘餌”的方式鎖定RIG-I，使其不與病毒RNA結(jié)合。

海量實(shí)驗(yàn) 頂級(jí)期刊的尖銳難題被逐個(gè)攻克

全新的發(fā)現(xiàn)，使得團(tuán)隊(duì)興奮異常。沒(méi)想到的是，更大的磨礪還在后面。

團(tuán)隊(duì)向頂級(jí)期刊投稿，審稿人卻要求必須用CLIP(交叉互連免疫沉淀)技術(shù)明確RNA的哪一個(gè)點(diǎn)和蛋白質(zhì)相互作用，連接在一起。用語(yǔ)言很難解釋蛋白質(zhì)和RNA在活體細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，姜明紅給科技日?qǐng)?bào)記者畫圖：一個(gè)長(zhǎng)鏈RNA會(huì)結(jié)合多個(gè)蛋白，這些蛋白有的是特異連接，連得緊密，有的就是“掛”在上面，而蛋白之外還會(huì)帶上其他的RNA，“纏繞”“連帶”“虛實(shí)”……

CLIP很難做，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室極少有成熟的經(jīng)驗(yàn)。收到修改意見(jiàn)后的團(tuán)隊(duì)成員開始大量查閱論文。“國(guó)外的實(shí)驗(yàn)流程無(wú)法完全照搬，不同的細(xì)胞做法不同，需要重新摸條件。”團(tuán)隊(duì)中主要攻關(guān)這一技術(shù)的劉倫說(shuō)。

CLIP技術(shù)和RIP(RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀)技術(shù)類似，但是卻能夠達(dá)到單個(gè)堿基的分辨率。為此，通過(guò)海量實(shí)驗(yàn)，針對(duì)裂解液的成分如何影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，團(tuán)隊(duì)開始了如指掌;不同RNA酶的脾氣也熟練掌握。

“實(shí)驗(yàn)室的部分我們自己攻克了，但是測(cè)序公司表示無(wú)法進(jìn)行匹配的測(cè)序工作，原因是無(wú)法合成特有的適當(dāng)引物。”劉倫說(shuō)，國(guó)內(nèi)沒(méi)有公司生產(chǎn)CLIP所需引物，而RNA測(cè)序必須先反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能夠進(jìn)行，引物決定了反轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性，決定了目標(biāo)位點(diǎn)能否確定。實(shí)驗(yàn)室自己擔(dān)負(fù)起RNA轉(zhuǎn)錄、構(gòu)建cDNA文庫(kù)的工作。完成3代測(cè)序、用化學(xué)方法測(cè)量分子間的相互作用力……這些免疫研究實(shí)驗(yàn)室原本并不擅長(zhǎng)的難題被團(tuán)隊(duì)逐個(gè)攻克。

按圖索驥 摸索并掌握一套獨(dú)有技術(shù)體系

根據(jù)已有發(fā)現(xiàn)，團(tuán)隊(duì)按圖索驥，利用分子篩層析實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺失lnc-Lsm3b表達(dá)的巨噬細(xì)胞在感染病毒以后，多聚化的RIG-I蛋白顯著增加。他們推測(cè)，病毒RNA與RIG-I結(jié)合以后，能夠誘導(dǎo)RIG-I單體形成多聚化狀態(tài)，從而激活下游信號(hào)通路。而lnc-Lsm3b只與單體結(jié)合，可能是通過(guò)抑制RIG-I的多聚形成抑制RIG-I的活性。

“Lsm3b只能結(jié)合單體的RIG-I蛋白、一條鏈能結(jié)合9個(gè)蛋白、結(jié)合力比病毒RNA高……”這些都是對(duì)這個(gè)全新RNA分子的多角度了解。

如同向“黑洞”中打進(jìn)一束光，曹雪濤團(tuán)隊(duì)在對(duì)現(xiàn)有知識(shí)體系顛覆的同時(shí)，肯定地回答了學(xué)界之前關(guān)于這類自身RNA分子是否存在、功能幾何的爭(zhēng)議。

“過(guò)去我們用別人的技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在我們自己摸索并掌握一套獨(dú)有的技術(shù)。”曹雪濤說(shuō)，整個(gè)研究的“練兵”不僅拓展了人類的“知識(shí)域”，還拓展了實(shí)驗(yàn)室的思路和眼界。接到《細(xì)胞》雜志編輯部發(fā)來(lái)修改要求時(shí)感受到的“不可思議”和巨大壓力，團(tuán)隊(duì)成員現(xiàn)在已能笑談。

“只是這段RNA與人類的同源性很低。”姜明紅表示了小小的惋惜，這意味著，該發(fā)現(xiàn)無(wú)法直接應(yīng)用于人類的新藥創(chuàng)制領(lǐng)域，但是，其他擁有人源細(xì)胞材料的機(jī)構(gòu)，可以沿著這條路，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)人類機(jī)體內(nèi)是否存在相似的RNA。曹雪濤更看重的是，確定靶點(diǎn)的方法一旦被高質(zhì)量地掌握，就能夠確定蛋白質(zhì)的靶點(diǎn)，進(jìn)而確定藥物作用的靶點(diǎn)，助力抗病毒藥物的研發(fā)。