當(dāng)?shù)貢r間3月31日，頂級學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》（Cell）在線發(fā)表了中國團(tuán)隊的一項最新研究，題為“針對SARS-CoV-2和新出現(xiàn)變異株的環(huán)狀RNA疫苗”（Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants）。該研究首次報道了環(huán)狀RNA疫苗技術(shù)平臺，以及據(jù)此開發(fā)的針對新冠病毒及其一系列變異株的環(huán)狀RNA疫苗。

北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授魏文勝課題組博士后璩良、博士研究生伊宗裔和沈勇為論文共同第一作者，魏文勝系通訊作者。此外，北京大學(xué)謝曉亮教授/曹云龍研究員課題組、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院王健偉教授課題組、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所彭小忠教授課題組、中國食品藥品檢定研究院王佑春課題組及黃維金課題組等均提供了支持。

實際上，該研究于今年1月在預(yù)印本bioRxiv提前發(fā)布，而和團(tuán)隊在去年3月發(fā)表的 bioRxiv論文相比，他們繼小鼠后在恒河猴上也驗證了他們開發(fā)的編碼新冠病毒刺突蛋白三聚體受體結(jié)合域（RBD）的環(huán)狀RNA疫苗（circRNA^RBD）能夠引發(fā)有效的中和抗體和T細(xì)胞應(yīng)答。

研究團(tuán)隊指出，該項研究中制備的針對新冠病毒德爾塔變異株的環(huán)狀RNA疫苗（circRNA^RBD-Delta）對多種新冠病毒變異株具有廣譜保護(hù)力。他們認(rèn)為，該疫苗可作為具有廣譜保護(hù)力的新冠候選疫苗，也為針對當(dāng)前新冠變異株迅速傳播的疫苗研發(fā)和接種策略提供了參考依據(jù)。

新冠肺炎病毒circRNA疫苗研發(fā)示意圖。

新疫苗的需求及mRNA疫苗技術(shù)制約

論文中寫道，隨著疫情的發(fā)展，出現(xiàn)了具有免疫逃逸能力的變異株，其中最嚴(yán)重的是奧密克戎（Omicron），該毒株現(xiàn)已成為全球大流行的主導(dǎo)毒株。其在刺突蛋白（S蛋白）上攜帶30多個突變，其中15處位于受體結(jié)合域(RBD)，導(dǎo)致此前研發(fā)的中和抗體的有效性顯著下降。

研究團(tuán)隊認(rèn)為，盡管通過原有的SARS-CoV-2疫苗加強針接種后，可以部分提高其中和能力，但奧密克戎偽病毒的中和能力仍比野生型低4-13倍。這對現(xiàn)有疫苗的效力構(gòu)成了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，突出表明迫切需要開發(fā)針對這種快速傳播的變異株的有效疫苗。

傳統(tǒng)的滅活、病毒樣顆粒等疫苗平臺已被用于開發(fā)新冠疫苗，且證明了安全性和有效性。當(dāng)然，在這場疫情中，最受矚目的是，針對新冠病毒的mRNA疫苗以極快的速度開發(fā)出來，并迅速被批準(zhǔn)使用。而在此之前，該疫苗開發(fā)策略仍處于臨床試驗階段，也從未被用于商業(yè)用途。

作為近幾年興起的突破性醫(yī)學(xué)技術(shù)，mRNA疫苗的基本原理是通過脂納米顆粒（LNP）將mRNA導(dǎo)入體內(nèi)來表達(dá)抗原蛋白，以刺激機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。COVID-19爆發(fā)后，莫德納的mRNA-1273、輝瑞/BioNTech的BNT162b2，這樣的針對性的mRNA疫苗在多種疫苗類型中脫穎而出。

不過，具有生產(chǎn)速度快、成本低，并且能快速應(yīng)對病毒變異等優(yōu)點的mRNA疫苗也有著一些短板。例如，其儲存和運輸條件較為苛刻（零下70℃），并具有潛在的免疫原性副作用。

同時，魏文勝在提供給澎湃新聞（www.thepaper.cn）記者的一份資料中還指出，mRNA疫苗的修飾及遞送技術(shù)均產(chǎn)生于國外機構(gòu)，制約了我國mRNA疫苗及其治療技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，因此亟需發(fā)展新型、高效的疫苗技術(shù)。

與線性的mRNA不同，環(huán)狀RNA分子呈共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不含5-Cap和3’-polyA結(jié)構(gòu)；且不需要引入修飾堿基, 其穩(wěn)定性高于線性RNA。環(huán)狀RNA是非編碼RNA中的一大類，它由一種非經(jīng)典剪接方式即反向剪接(backsplicing)產(chǎn)生。其發(fā)現(xiàn)于1976年，并在近幾年里成為了新一代的明星分子。

研究團(tuán)隊指出，相比之下，環(huán)狀RNA由于其共價封閉的環(huán)結(jié)構(gòu)而高度穩(wěn)定，這可以保護(hù)其免受外切酶介導(dǎo)的降解。據(jù)此前報道，環(huán)狀RNA比線性mRNA更穩(wěn)定，在哺乳動物細(xì)胞中，環(huán)狀RNA的中位半衰期至少比線性mRNA長2.5倍。

不過，迄今為止，只有少數(shù)內(nèi)源性環(huán)狀RNA被證明具有蛋白質(zhì)翻譯模板的功能。天然的環(huán)狀RNA因為沒有5’端的帽子結(jié)構(gòu)，一般無法進(jìn)行翻譯。不過，它可以通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)或加入開放閱讀框(ORF)上游的m6A修飾來實現(xiàn)蛋白質(zhì)翻譯。

因此，研究團(tuán)隊設(shè)想，環(huán)狀RNA可以作為一個產(chǎn)生免疫原的平臺。魏文勝等人也同時指出，RNA的環(huán)化方法、純化策略尚不成熟，其潛在的免疫原性對疫苗研發(fā)的影響并不清楚，諸多未知因素也制約著環(huán)狀RNA的研發(fā)應(yīng)用。

魏文勝對澎湃新聞記者表示，其團(tuán)隊環(huán)狀RNA疫苗的研發(fā)工作在疫情暴發(fā)后啟動。

論文顯示，研究團(tuán)隊采用Group I核酶自催化策略來產(chǎn)生編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環(huán)狀RNA，稱為circRNA^RBD。為了增強RBD抗原的免疫原性，在RBD的N端添加了信號肽序列（SP），以實現(xiàn)其分泌表達(dá)。在這個結(jié)構(gòu)中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)元素置于RBD編碼序列之前以啟動其翻譯。為了增強RBD抗原的免疫原性，他們還將人組織型纖溶酶原激活物(tPA)的信號肽序列融合到RBD的N端，以確?？乖姆置?。

此外，鑒于S蛋白三聚體在結(jié)合hACE2方面表現(xiàn)優(yōu)于單體S蛋白，同時為提高RBD抗原的免疫原性，將T4噬菌體纖維蛋白(Foldon)的三聚化基序融合到其C端。然后將該IRES-SP-RBD-Foldon序列插入環(huán)化載體，構(gòu)建用于產(chǎn)生circRNA^RBD的體外轉(zhuǎn)錄（IVT）模板。

初步顯示：設(shè)計疫苗有效中和奧密克戎株在內(nèi)的多種變異株

魏文勝等人提到，實驗證明，編碼新冠病毒刺突蛋白RBD的環(huán)狀RNA疫苗可以在小鼠和恒河猴體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的新冠病毒中和抗體以及特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，并可以有效降低新冠病毒感染的恒河猴肺部的病毒載量，顯著緩解新冠病毒感染引起的肺炎癥狀。

CircRNA疫苗接種在小鼠和恒河猴體內(nèi)提供了顯著性保護(hù)。一系列的對比評估表明，與mRNA疫苗相比，circRNA疫苗具有以下特點或優(yōu)勢：circRNA具有更高的穩(wěn)定性，可以在體內(nèi)產(chǎn)生更高水平、更加持久的抗原；circRNA疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的中和抗體比例更高，可以更有效地對抗病毒變異，降低疫苗潛在的抗體依賴增強癥（ADE）副作用；circRNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG2/IgG1的比例更高，表明其主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型保護(hù)性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，可以有效降低潛在的疫苗相關(guān)性呼吸道疾病（VAERD）副作用。

CircRNA疫苗的特點和優(yōu)勢（相比于mRNA疫苗）。此外，值得一提的是，在奧密克戎突變株被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為值得關(guān)注的變異株（VOC）后，研究團(tuán)隊還緊急啟動了針對該突變株的環(huán)狀RNA疫苗研發(fā)。

在獲得病毒序列信息的30天內(nèi)，研究團(tuán)隊完成了從疫苗生產(chǎn)、小鼠免疫到有效性評估的全流程。研究發(fā)現(xiàn)，基于奧密克戎變異株的環(huán)狀RNA疫苗（circRNA^RBD-Omicron）的保護(hù)范圍狹窄，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體只能夠中和奧密克戎變異株。

不過，針對德爾塔變異株設(shè)計的環(huán)狀RNA疫苗（circRNA^RBD-Delta）可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生廣譜的中和抗體，有效中和包括奧密克戎株在內(nèi)的多種新冠變異株。他們在討論中指出，這一針對德爾塔變異株設(shè)計的環(huán)狀RNA疫苗或許可以作為現(xiàn)有疫苗接種后的有效加強針選擇，希望進(jìn)一步的試驗?zāi)茏C明這一點。

針對新冠病毒德爾塔變異株設(shè)計的circRNARBD-Delta疫苗是一種具有廣譜保護(hù)力的候選疫苗。此外，研究團(tuán)隊也提到，盡管這項研究工作并沒有專門研究疫苗或藥物的安全性, 值得注意的是，circRNA疫苗并未在研究中接種后的非人類靈長類動物中引起臨床癥狀或增強病理，這一點為基于環(huán)狀RNA的疫苗或藥物的開發(fā)開辟了道路。

研究團(tuán)隊總結(jié)稱，以上結(jié)果表明，針對新冠病毒德爾塔變異株設(shè)計的circRNA^RBD-Delta疫苗是具有廣譜保護(hù)力的新冠肺炎候選疫苗，該研究也為針對當(dāng)前新冠變異株迅速傳播的疫苗研發(fā)和接種策略提供了參考依據(jù)。

同時，他們認(rèn)為，該項平臺型技術(shù)的建立在感染性疾病、自身免疫病、罕見病以及癌癥的預(yù)防或治療中也具有廣泛的應(yīng)用前景。

魏文勝表示，后續(xù)的主要工作在于推產(chǎn)業(yè)化。值得關(guān)注的是，據(jù)北京大學(xué)此前官網(wǎng)報道，魏文勝團(tuán)隊已成功將環(huán)狀RNA技術(shù)轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力，成立圓因（北京）生物科技有限公司，專注于利用環(huán)狀RNA （circRNA）技術(shù)開發(fā)疫苗及新型療法。